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免疫浊度测定

点击次数:1233 发布时间:2017-05-08
 免疫浊度测定(immunoturbidimetry)是将现代光学测量仪器与自动化分析检测系统相结合应用于沉淀反应,可对各种液体介质中的微量抗原、抗体和药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定。当可溶性抗原与相应抗体特异结合,在二者比例合适时,在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物,使反应液体出现浊度。1959年Schultze等根据抗原抗体结合后形成的复合物能引起液体介质出现浊度改变的原理,建立了透射比浊法(turbidimetry),形成的浊度使光线的透过量减少,则光线被吸收的量与免疫复合物(immune complex,IC)形成量呈正相关,从而根据所测吸光度值即可推算出待测抗原的量。1967年Ritchie等利用激光照射在液相中的IC微粒上时部分光线发生散射的原理,通过测量散射光的强度来求得待测抗原的量,这种比浊测定称为散射比浊法(nephelometry)。1977年Sternberg进一步发展建立了速率散射比浊法(ratenephelometry),成为目前定量测定微量抗原物质并广泛使用的一种高灵敏度、快速的自动化免疫比浊测定法。免疫浊度测定可分为速率比浊法和终点比浊法两种。 

  (一)免疫比浊测定的影响因素 

  1.抗原抗体的比例 抗原抗体的比例是浊度形成的关键因素,当抗原和抗体的比例适当时,二者全部结合,既无过剩的抗原,也无过剩的抗体,这时免疫复合物(1C)的形成和解离相等,其反应式为:Ag+Ab—Ag·Ab。 

  当抗原过量时,形成的IC分子小,而且会发生再解离,使浊度反而下降,光散射亦减少,这就是高剂量钩状效应(high does hook effect)。当反应液中抗体过量时,IC的形成随着抗原递增而增加,至抗原、抗体zui适比例处达zui高峰,这就是经典的海德堡(Heidelberger)曲线理论。 

  因此,免疫比浊法的基本原理就是在反应体系中保持抗体过量,如形成抗原过量则造成测定的准确性降低。 

  2.抗体的质量 免疫比浊测定法要求抗体的特异性强、效价高、亲和力强,并使用R型抗体。 

  (1)抗体的特异性:抗血清zui核心的要求是单价特异性,即该抗体只针对某一种抗原,与其他无关抗原不发生交叉反应,特异性抗体和相应抗原结合后形成的浊度代表真实的试验结果。 

  (2)抗体的效价:低效价(<1:20)抗体会增加非特异性浊度(伪浊度)的产生。 

  (3)抗体的亲和力:亲和力是指抗体和抗原结合的牢固程度。亲和力强则抗体的活性高,不仅可以加快抗原抗体反应的速度,而且形成的IC较牢固,不易发生解离,这在速率比浊法中尤为重要。 

  (4)R型和H型抗体:根据抗血清来源的动物种类不同,分为R型(rabbittype)抗体和H型(horsetype)抗体。R型抗体是指以家兔为代表的小型动物被注射抗原免疫后制备的抗血清。这类抗血清的特点是亲和力较强,抗原抗体结合后不易发生解离,H型抗体是指以马为代表的大型动物注射抗原后制备的抗血清,这类抗血清的亲和力弱,抗原抗体结合后极易解离。 

  3.抗原抗体反应的溶液 抗原抗体反应液的zui适pH为6.5—8.5,超过此限度则不易形成IC,甚至可引起IC解离。在一定范围内,离子强度大,IC形成快;离子的种类也可影响IC的形成,由慢到快依次为SCN—、ClO了、N03、Br—、Cl—、S(X—、H:P04和HPO扩。因此,一般常使用磷酸盐缓冲液作为免疫比浊法的反应液。 

  4.增浊剂 某些非离子型亲水剂对促进IC的形成有显著的增强作用,如聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)、吐温-20(tween-20),其作用是消除蛋白质(抗原或抗体)分子周围的电子云和水化层,促进抗原、抗体分子靠近,结合形成大分子复 

  (二)免疫比浊方法分类 

  1.透射免疫比浊法 通过检测光被吸收、衍射、反射和折射后光线减弱的变化,来定量抗原抗体的复合物。 

  2.散射免疫比浊法 通过检测光折射和衍射而形成的散射光强度来定量抗原抗体的复合物。该法根据抗原抗体反应的时间和反应结合的动力学,又可分为终点散射比浊法、固定时间散射比浊法和速率散射比浊法。 

  3.免疫胶乳比浊法 是以胶乳作为载体对小分子免疫复合物进行微量测定,进一步提高了免疫浊度测定的灵敏度。 
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